Typer af fluorescensmikroskoper

Da mikroskoper blev opfundet omkring 1600 e.v.t., vendte naturfilosoffer deres øjne mod en verden i en verden. Da Antony van Leeuwenhoek lavede små, stærkt buede linser og en mekanisk holder til at justere udsigten, åbnede han et vindue mod den mikroskopiske verden af ​​bakterier, blodlegemer, protozoer og plantestrukturen. Men gennem mikroskopiets historie har der altid været et spørgsmål: Hvad er disse mærkelige ting set gennem en linse? Fluorescensmikroskopi henviser til et sæt teknikker, der minimerer denne usikkerhed - for i fluorescensmikroskopi, når lys skinner på en prøve, skinner det sit eget lys med det samme.

Epifluorescens

Langt det mest almindelige fluorescensmikroskop er epifluorescens-konfigurationen. I et epifluorescensmikroskop skinner en lyskilde - typisk en kviksølv- eller xenonlampe - gennem et filter, der vælger et smalt område af bølgelængder. Det filtrerede lys skinner på prøven gennem objektglaset til mikroskopet. Det indgående lys absorberes af fluoroforer - molekylære mærker, der udsender lys med en lang bølgelængde, når de absorberer lys med en kortere bølgelængde. Lys fra fluoroforer sammen med spredt lys fra belysningskilden går tilbage i objektivlinjen og til detektoren eller øjet. Undervejs blokerer et andet filter belysningslyset ud, så alt der er tilbage er det fluorescerende lys fra prøven.

Konfokal

Et epifluorescensmikroskop samler lys overalt inden for mikroskopets synsfelt. Noget af excitationslyset absorberes før mikroskopets brændplan, nogle i brændplanet og noget ud over brændplanet. Fordi mikroskopet samler alt det lys, vil billedet indeholde et skarpt lysbillede i fokus, men det vil også have lys uden for fokus fra andre regioner. Et konfokalt mikroskop fixer det ved at fokusere et laserplet i samme plan som mikroskopet er fokuseret. Derefter går et pinhole foran detektoren, hvor det blokerer alt det lys, der ikke kommer fra mikroskopfokus. Ved at scanne prøven kan der opnås et rent tredimensionelt billede af objektet.

Multiphoton

I et konfokalt mikroskop er tilpasningen meget følsom. Hvis laserpletten, mikroskopobjektivet, opsamlingsoptikken og pinhullet er slukket, selv den mindste mængde, mikroskopets ydeevne lider under. Et multiphoton-mikroskop omgår dette problem ved hjælp af en laserbølgelængde, der kun er halvt så energisk som det skal være for at excitere fluoroforerne i prøven. Den eneste måde, hvorpå fluoroforer bliver ophidsede og udsender fluorescens, er, hvis laserlyset er lyst nok, så to lyspartikler - fotoner - rammer fluoroforen på meget kort tid. Det sker kun, når laseren er fokuseret til et meget lille sted. Så det eneste sted i prøven, der udsender lys, er, hvor laseren er fokuseret, hvilket holder billedet pænt og rent, fordi der ikke er noget ekstra baggrundslys at slippe af med - hvilket betyder, at der ikke er nogen pinhole til at justere.

Total intern refleksionsfluorescens (TIRF)

En anden måde at få meget rene billeder på er at sikre, at excitationslyset ikke kommer meget langt ind i prøven. Hvis en blob af neuroner f.eks. Placeres i en dråbe opløsning på et glasskinne, vil nogle af neuronerne klæbe til glasoverfladen. I en total intern refleksionsfluorescens (TIRF) -mikroskop ledes lyset sidelæns ind i glasskærmen, så det ikke rigtig kommer ind i den opløsning, der holder cellerne. Men noget af lyset lækker næsten ikke op i løsningen - bare meget tæt på glassets overflade. Dette betyder, at de eneste steder, der udsender lys, vil være i et meget tyndt område lige op mod glasoverfladen. For noget som neuroner, hvor der sker så mange interessante ting på overfladen af ​​cellerne, kan denne teknik være meget effektiv.

Superopløsning

Alle mikroskoper - inklusive fluorescensmikroskoper - er begrænset af den fysik, der styrer udbredelsen af ​​lys. En af de grundlæggende regler er, at et fokuseret lyspunkt kun kan blive så lille - og ikke mindre. For synligt lys er størrelsen ca. 200 nanometer eller 200 milliardedele af en meter. Men enkeltmolekyler er kun få nanometer store, så der er masser af interessante funktioner, der er under denne størrelsesgrænse, kaldet diffraktionsgrænsen. Forskere udvikler "superopløsnings" -teknikker for at snige sig omkring den grænse. Struktureret belysningsmikroskopi (SIM) og stimuleret emission depletion (STED) mikroskopi er for eksempel begge fluorescensmikroskopimetoder, der begrænser størrelsen på det lysemitterende sted ved at krympe størrelsen på excitationslyspunktet.